La combinación de capacidades inmunomoduladoras, angiogénicas y osteogénicas en un andamio de ingeniería de tejidos de hidrogel piezoeléctrico para la medicina militar.

Investigación médica militar volumen 10, número de artículo: 35 (2023) Citar este artículo

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La mayoría de las lesiones óseas que sufren las tropas de base son causadas por entrenamiento o lesiones accidentales. Para establecer medidas preventivas para reducir todo tipo de traumatismos y mejorar la efectividad en el combate de las tropas de base, es imperativo desarrollar nuevas estrategias y andamios para promover la regeneración ósea.

En este estudio, se fabricó un armazón óseo de hidrogel piezoeléctrico poroso incorporando nanopartículas de hidroxiapatita cerámica modificada con polidopamina (PDA) (PDA-hidroxiapatita, PHA) y titanato de bario modificado con PDA (PDA-BaTiO3, PBT) en un compuesto de quitosano/gelatina (Cs /Gel) matriz. Se analizaron las propiedades físicas y químicas del andamio Cs/Gel/PHA con 0–10% en peso de PBT. Se realizaron experimentos con células y animales para caracterizar las capacidades inmunomoduladoras, angiogénicas y osteogénicas del andamio de hidrogel piezoeléctrico in vitro e in vivo.

La incorporación de BaTiO3 al andamio mejoró sus propiedades mecánicas y aumentó la electricidad autogenerada. Debido a su estimulación piezoeléctrica endógena y componentes bioactivos, los hidrogeles de Cs/Gel/PHA/PBT preparados exhibieron citocompatibilidad, así como capacidades inmunomoduladoras, angiogénicas y osteogénicas; no solo indujeron eficazmente la polarización de los macrófagos al fenotipo M2, sino que también promovieron la migración, la formación de tubos y la diferenciación angiogénica de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y facilitaron la migración, la osteodiferenciación y la mineralización de la matriz extracelular (ECM) de MC3T3-. Células E1. Las evaluaciones in vivo mostraron que estos hidrogeles piezoeléctricos con capacidades versátiles facilitaron significativamente la formación de hueso nuevo en un modelo de lesión craneal de gran tamaño en rata. El mecanismo molecular subyacente se puede atribuir en parte a la inmunomodulación de los hidrogeles Cs/Gel/PHA/PBT como se muestra mediante el análisis de secuenciación del transcriptoma, y ​​el eje de señalización PI3K/Akt juega un papel importante en la regulación de la polarización de los macrófagos M2.

Los hidrogeles piezoeléctricos Cs/Gel/PHA/PBT desarrollados aquí con funciones favorables de inmunomodulación, angiogénesis y osteogénesis pueden usarse como sustitutos en lesiones del periostio, ofreciendo así la novedosa estrategia de aplicar estimulación piezoeléctrica en ingeniería de tejido óseo para mejorar la efectividad en el combate. en tropas de base.

Además de las enfermedades, las lesiones durante el entrenamiento y las lesiones accidentales son causas importantes de la reducción de tropas fuera de combate en las tropas de base en condiciones de no guerra. De todas las lesiones, el 70,3% fueron lesiones de entrenamiento y el 29,7% fueron lesiones fuera de entrenamiento. Un total del 66,6% de las lesiones relacionadas con los huesos fueron causadas por dicho entrenamiento y lesiones accidentales [1, 2]. Para establecer medidas preventivas para reducir todo tipo de traumatismos y mejorar la efectividad en el combate de las tropas de base, es imperativo desarrollar nuevos medicamentos y andamios para promover la reparación de lesiones óseas [3, 4]. La curación de lesiones óseas es un gran desafío debido al riesgo de inflamación persistente y no controlada, interrupción del suministro de oxígeno debido al bloqueo de la osteogénesis/angiogénesis y sobrecarga de especies reactivas de oxígeno (ROS) [5]. El uso de material de soporte de ingeniería de tejido óseo, que puede proporcionar un microambiente para la regeneración ósea, es una estrategia alternativa eficaz para apoyar la regeneración ósea [6]. En la actualidad, el efecto de muchas estructuras de ingeniería de tejido óseo es similar al del trasplante de hueso autólogo [7], y se han introducido muchos métodos nuevos, como la estimulación eléctrica, en el campo de la ingeniería de tejido óseo refractario [8]. Sin embargo, optimizar el uso combinado de estas tecnologías sigue siendo un desafío.

Muchos informes han demostrado que el microambiente eléctrico puede desempeñar un papel importante en la reparación de lesiones óseas [9, 10]. Además, la señalización eléctrica en el cuerpo puede regular los comportamientos de los macrófagos, como la migración, la actividad fagocítica y la producción de citoquinas [11]. Además de la incorporación de macromoléculas y nanomoléculas bioactivas de uso frecuente, una creciente investigación ha descubierto que múltiples señales fisiológicas, incluidas la mecánica, la electricidad y el magnetismo, representan nuevas perspectivas para la regeneración ósea al influir en los comportamientos celulares relacionados con los huesos y en los eventos de maduración celular [12]. . Por ejemplo, el tejido óseo en sí es piezoeléctrico y se autoalimenta en respuesta a las actividades mecánicas del cuerpo, que pueden regular el metabolismo y la proliferación de los osteocitos [13]. Los biomateriales piezoeléctricos, como el ácido poli-L-láctico, el colágeno, la seda y el niobato de potasio y sodio, pueden generar el microambiente eléctrico fisiológico y desempeñar un papel importante en el aumento de las actividades metabólicas [14, 15]. Es importante destacar que, desde el descubrimiento de las propiedades bioeléctricas del hueso hace 70 años, la terapia de electroestimulación clínica ha demostrado la capacidad de facilitar la curación ósea y la fusión espinal [16]. Recientemente, se ha demostrado que la electroestimulación in vitro tiene efectos positivos sobre la proliferación, migración y diferenciación de las células formadoras de hueso (células madre mesenquimales óseas, osteoprogenitores, osteoblastos y células endoteliales) [17]. Los posibles mecanismos por los cuales la electroestimulación promueve la osteogénesis implican la regulación positiva de las concentraciones intracelulares de Ca2+ relacionadas con los osteoblastos, la apertura primaria de canales de Ca2+ dependientes de voltaje y la osteogénesis acelerada a través de la regulación positiva de las vías de señalización de la calmodulina [18].

Además, la formación de hueso nuevo después de defectos óseos está estrechamente relacionada con la vascularización, y los vasos sanguíneos nuevos pueden participar en una serie de procesos fisiológicos y patológicos de regeneración ósea, actuando así como vínculos importantes para la regeneración ósea después de la pérdida ósea. El estrés oxidativo excesivo disminuye la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), lo que dificulta en gran medida la función de angiogénesis del sitio del defecto óseo. Los estudios han demostrado que la electroestimulación puede promover la dilatación vascular, mejorar la permeabilidad vascular y aumentar el flujo sanguíneo tisular local [19,20,21]. La estimulación eléctrica también puede estimular las células endoteliales vasculares cercanas a la necrosis de la fractura para que se neovascularicen y crezcan hacia el extremo isquémico, proporcionando suministro de sangre al tejido lesionado. La neovascularización está estrechamente relacionada con la expresión de VEGF; sin embargo, no todos los tipos de estimulación eléctrica promueven la expresión de VEGF [22]. Por ejemplo, Srirussamee et al. [23] demostraron que la estimulación con corriente continua no promovía la expresión de VEGF en los preosteoblastos. Kim y cols. [24] confirmaron que la estimulación con corriente alterna (CA) podría aumentar significativamente la expresión de VEGF cuando se mide mediante experimentos de RT-PCR y ELISA. En nuestra investigación anterior, construimos películas piezoeléctricas combinando nanomateriales piezoeléctricos, que podrían generar CA impulsada por fuerzas mecánicas [25, 26]. Además, demostramos que la estimulación con CA podría promover eficazmente la expresión de VEGF en sitios con defectos tisulares y, por lo tanto, estimular la generación de nuevos vasos sanguíneos [19]. Dobashi et al. [27] desarrollaron hidrogeles piezoiónicos que podrían transducir estímulos de presión en corrientes para aplicaciones de neuromodulación. Dado este contexto, existe una necesidad urgente de desarrollar un material de soporte de ingeniería de tejido óseo que pueda regular el microambiente inmunológico y generar CA bajo acción mecánica.

En este estudio, se fabricó un armazón óseo de hidrogel piezoeléctrico dopando nanopartículas de titanato de bario modificado con polidopamina (PDA) (PDA-BaTiO3, PBT) y nanopartículas de hidroxiapatita cerámica modificada con polidopamina (PDA-HA, PHA) en quitosano/gelatina [Cs/ Gel (CG)] hidrogeles. Se probaron las propiedades físicas y químicas para verificar que el cambio en las propiedades del hidrogel piezoeléctrico se debió a la introducción de BaTiO3. Como los hidrogeles piezoeléctricos modificados con Cs/Gel/PDA, HA/BaTiO3 (CG/PHA/PBT) modificados con PDA podrían proporcionar electroestimulación estabilizada in situ, se evaluó la utilidad de los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT para la reparación de huesos de gran tamaño. para examinar la capacidad pro-curación in vivo, la función inmunomoduladora y la actividad angiogénica y osteogénica. Finalmente, se realizó un análisis de experimentos de inhibición y transcriptómica de ARN para verificar la vía de señalización clave para regular la regeneración ósea mediante hidrogeles piezoeléctricos.

Cs, gel y clorhidrato de dopamina se adquirieron de Sigma-Aldrich Co., Ltd. (9012-76-4, 9000-70-8, H8502; St. Louis, MO, EE. UU.). Las nanopartículas de BaTiO3 fueron proporcionadas por Alfa Aesar (12047-27-7; Wardhill, MA, EE. UU.). Para experimentos de cultivo celular, suero bovino fetal, medio de Eagle modificado alfa (α-MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), solución salina tamponada con fosfato (PBS), ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) y penicilina/estreptomicina (P/S) se obtuvieron de Gibco Life Technologies Co. (10100147, 12571063, 11965092, 70011044, 17892, 15070063; Grand Island, EE. UU.). El kit de recuento celular-8 (CCK-8) se adquirió de Dojindo Laboratories (CK04; Kumamoto, Japón). El kit de tinción de células vivas/muertas se obtuvo de BestBio Biotechnologies (C2015M; Shanghai, China). Se utilizaron Triton X-100 (9036-19-5; Sigma-Aldrich), DAPI (28718-90-3; Sigma-Aldrich) y faloidina marcada con TRITC (A34055; Invitrogen, EE. UU.) para la tinción celular. La tinción Hoechst 33342, el kit de imágenes BeyoClick™ EdU-555, el kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC, el kit de extracción de ARN TRIzol, el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA), el 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul tetrazolio (BCIP/NBT), el kit de desarrollo de color de fosfatasa alcalina (ALP) y el kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) fueron suministrados por Beyotime Biotechnology Co., Ltd. (C1022, C0075S, C1062S, R0016, P0013B, C3206, P0321M, P0009 ; Jiangsu, China). La solución de tinción con rojo de alizarina S (ARS) se adquirió de Servicebio Co., Ltd. (G1038; Wuhan, China). Todos los químicos fueron usados ​​sin purificación adicional. El agua utilizada en todos los experimentos se purificó mediante un sistema de purificación de ciclo Milli-Q (Millipore, EE. UU.).

La preparación de PHA y PBT se muestra en la Fig. 1a. Se dispersó 1 g de nanopartículas de HA o BaTiO3 en una solución de PDA y se mantuvo a 37 ° C durante 12 h. Las nanopartículas se recogieron mediante centrifugación en gradiente. Para la preparación de los hidrogeles piezoeléctricos, se disolvió Cs en acetum al 1% [2% (p/v)] y el gel se disolvió completamente en agua desionizada [2% (p/v)]. Las soluciones de Cs y Gel se mezclaron en una proporción de 1:1 para formar una solución de CG. El polvo de PHA se añadió a la solución de CG al 10 % del peso total del CG para obtener una suspensión de CG/PHA. Luego, se añadió el polvo de PBT a la solución anterior en proporciones de 0, 5 y 10% en peso del peso total. Se añadieron en serie cien microlitros de solución de genipina [2% (p/v)] a alícuotas de 10 ml de la solución CG/PHA/PBT, se agitaron durante 10 minutos hasta que se mezclaron y luego se vertieron en placas para la formación de gel. En las siguientes secciones, los hidrogeles CG puros se denominan grupo CG, los hidrogeles CG nanocompuestos con funcionalización PHA se denominan grupo CG/PHA y los hidrogeles CG nanocompuestos con 5% en peso y 10% en peso de funcionalización PBT se denominan CG/ Grupos PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT, respectivamente.

Ilustración esquemática de la estrategia de diseño de los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT y el mecanismo de regeneración ósea. a El proceso de preparación de los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT. b La aplicación y el mecanismo biológico potencial de los hidrogeles piezoeléctricos para la rápida regeneración ósea. c Ilustración esquemática del posible mecanismo autoalimentado de los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT. Los dipolos de las nanopartículas BT están orientados en la misma dirección que los hidrogeles piezoeléctricos. La polarización eléctrica se presenta en la dirección de los dipolos orientados y puede producir un potencial piezoeléctrico en las nanopartículas piezoeléctricas BT. En ausencia de estímulos externos, existe un equilibrio de carga positivo y negativo en el hidrogel. Una vez que se aplica un estímulo de presión a los hidrogeles piezoeléctricos, los electrones de los hidrogeles salen del hidrogel. Una vez que desaparece la presión, las cargas libres acumuladas regresan a los hidrogeles piezoeléctricos. Titanato de bario BT, hidroxiapatita HA, quitosano Cs, gelatina en gel, hidroxiapatita recubierta con polidopamina PHA, titanato de bario recubierta con polidopamina PBT, electrón e, resistencia R, macrófagos no polarizados M0 mφ, macrófagos M1 mφ tipo 1, macrófagos M2 mφ tipo 2, IL-6 interleucina-6, IL-4 interleucina-4, factor de necrosis tumoral-α TNF-α, óxido nítrico sintasa inducible por iNOS, proteína 86 del grupo de diferenciación CD86, arginasa Arg1, célula estromal de médula ósea BMSC, vena umbilical humana HUVEC células endoteliales

Después de liofilizar los hidrogeles piezoeléctricos, se caracterizó la topografía de los hidrogeles piezoeléctricos con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FE-SEM; Zeiss, Sigma, Alemania) y se determinó la distribución de elementos Ca, P, Ba y Ti en los hidrogeles piezoeléctricos. escaneado con el espectrómetro de energía dispersiva (UltimMax 40, Oxford, Reino Unido). Los cambios de grupo de funciones en los hidrogeles piezoeléctricos se probaron mediante difracción de rayos X (XRD; Rigaku, Japón) y espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR; TNZ1-5700, Nicolet, EE. UU.). El módulo de elasticidad de los hidrogeles piezoeléctricos se realizó con un reómetro (Kinexus, Malvern). Los voltajes de salida de los hidrogeles piezoeléctricos se determinaron mediante un osciloscopio de almacenamiento digital (RTM3000, Rohde & Schwarz, Alemania).

Las células RAW 264.7 (línea celular de macrófagos derivada de murinos) fueron proporcionadas por el Instituto de Bioquímica y Biología Celular de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China) (ab275474; Abcam, EE. UU.). El ensayo CCK-8 se realizó para evaluar la citotoxicidad de los hidrogeles piezoeléctricos. Los extractos de los hidrogeles piezoeléctricos se obtuvieron según ISO1099312:2007. El medio de cultivo sin los extractos sirvió como control. Después de 1, 2 y 3 días de cultivo, se añadió la solución CCK-8 a cada pocillo (20 µl por pocillo) y las células se incubaron durante otras 4 h a 37 °C con 5% de CO2. Además, se realizó la tinción vivo/muerto para verificar la viabilidad de células RAW 264.7 en diferentes hidrogeles piezoeléctricos. Las células vivas se tiñeron de verde con Calceína-AM y las células muertas se tiñeron de rojo con yoduro de propilo (PI). El cultivo 3D de macrófagos (células RAW 264.7) con hidrogeles piezoeléctricos se realizó de manera similar al cultivo 2D. Para construir imágenes en 3D, los datos originales adquiridos mediante apilamiento en Z se procesaron utilizando el software Leica negro/azul (Leica). Todos estos experimentos para evaluar la apoptosis celular se realizaron en hidrogeles piezoeléctricos.

En primer lugar, se utilizó inmunofluorescencia para observar los cambios morfológicos en macrófagos cocultivados en diferentes muestras. Brevemente, después de cocultivar durante 2 días, las muestras se tiñeron con actina F y F4/80 y se tomaron fotografías con un microscopio confocal. A continuación, para la polarización fenotípica, se detectaron marcadores de superficie de macrófagos M1 (CD86) y macrófagos M2 (CD206) mediante citometría de flujo como se describió anteriormente [28]. Las células RAW 264.7 se trataron primero con lipopolisacárido (LPS) durante 24 h como un simple estímulo in vitro del microambiente inflamatorio durante la curación ósea. Luego se sembraron las células recolectadas en cada muestra en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos a una densidad de 3 x 104 células por pocillo. Después de una incubación durante 2 días, las células se recogieron mediante tripsinización y luego se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% durante 20 minutos. Después de enjuagar dos veces con PBS, se usaron CD86 conjugado con aloficocianina (APC) (105011, BioLegend, China) y CD206 conjugado con FITC (141703, BioLegend, China) para la tinción con antígeno de superficie durante 30 minutos. Las células tratadas se analizaron mediante citometría de flujo (FC500, EE. UU.) utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc., EE. UU.). La polarización de los macrófagos se analizó mediante tinción de inmunofluorescencia y ensayos de transferencia Western. Para la tinción por inmunofluorescencia, se utilizaron un anticuerpo monoclonal de ratón contra la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS; ab210823, Abcam, Reino Unido) y anticuerpos CD206 (marcador M2, PA5-101657, Invitrogen, EE. UU.) para detectar la polarización de los macrófagos. Los anticuerpos primarios contra iNOS (GTX130246, Genetex, EE. UU.), CD206 (24595S, Cell Signaling, EE. UU.) y GAPDH (ab8245, Abcam, Reino Unido) se incubaron para el ensayo de transferencia Western.

La eficacia antiinflamatoria del hidrogel piezoeléctrico se analizó más a fondo mediante RT-qPCR. Brevemente, después de cocultivar durante 2 días, se realizaron aislamiento de ARN total, síntesis de ADN complementario (ADNc) y RT-qPCR como se describe anteriormente. Los niveles de expresión genética se normalizaron con respecto a los del gen de mantenimiento endógeno GAPDH. Las secuencias de los cebadores de cada gen se presentan en el archivo adicional 1: Tabla S1.

Después de que los macrófagos se cocultivaron durante 2 días, se recogió el sobrenadante de cada grupo para realizar estudios adicionales según los protocolos informados previamente [29]. Después de centrifugar a 8000 r/min durante 5 minutos y filtrar a través de un filtro de 0,22 μm, los sobrenadantes estériles se recogieron cuidadosamente y se almacenaron a 4 °C. Además, las concentraciones de BMP-2, TGF-β1, VEGF y bFGF secretadas por las células en el sobrenadante recogido se midieron con los correspondientes kits de ELISA. Todas las mediciones de ELISA se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se llevó a cabo RNA-seq para estudiar los perfiles de expresión génica de macrófagos cultivados en diferentes hidrogeles. Brevemente, se cocultivaron macrófagos RAW 264.7 (1 x 106 células/ml) en diferentes muestras de hidrogel en placas de 24 pocillos durante 2 días. Luego, se recogió el ARN total de los macrófagos de cada grupo utilizando el reactivo TRIzol siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se almacenaron a –80 °C antes de la secuenciación. Finalmente, la secuenciación de ARN se realizó mediante BMK Cloud (https://www.biocloud.net/). La expresión de varios genes seleccionados se examinó mediante un mapa de calor y se evaluó mediante el análisis de rutas de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG).

Para verificar las vías de señalización posiblemente involucradas en la contribución de los hidrogeles piezoeléctricos a la polarización M2, se añadió un inhibidor (BEZ235, 0–200 nmol/L, Selleck, EE. UU.) de PI3K en medio de cultivo celular completo para cultivar células RAW 264.7 en piezoeléctricos. hidrogeles. Se cocultivó LPS (200 ng/ml) con macrófagos como control negativo. También se cocultivó interleucina-4 (IL-4, 20 ng/ml) con macrófagos como control positivo. Después de 48 h, se recogieron las células RAW 264.7 para un ensayo de tinción por inmunofluorescencia para detectar su polarización.

La actividad de migración de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC; CRL-1730, ATCC, EE. UU.) promovida por los hidrogeles piezoeléctricos se determinó mediante Transwell y ensayos de heridas por raspado in vitro [30]. Para el ensayo de la cámara Transwell, las células HUVEC se sembraron en la cámara superior. El medio de macrófagos se añadió en la cámara inferior. Las células migradas en la superficie inferior se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1% para su observación. Para el ensayo de herida por raspado, cuando las HUVEC alcanzaron el 90 % de confluencia, se creó un raspado recto. Se añadió el medio de macrófagos para estimular la migración de HUVEC. Las células HUVEC se fijaron y luego se tiñeron con una solución de cristal violeta para observar la migración.

El ensayo de formación de vasos se midió con HUVEC en diferentes medios de macrófagos para inducir la angiogénesis. En resumen, las células HUVEC se sembraron en la matriz de membrana basal reducida en factor de crecimiento (Matrigel, 356231, Corning, EE. UU.) y se incubaron con diferentes extractos de hidrogel. Luego se observaron y analizaron cuantitativamente las estructuras en forma de tubo. Además, la expresión de VEGF, factor inducible por hipoxia-1α (HIF-1α), bFGF y angiopoyetina-1 (Ang-1) se midió mediante RT-qPCR. Todas las secuencias de cebadores utilizadas en RT-qPCR se presentan en el archivo adicional 1: Tabla S1. Después de cultivar durante 7 días, se realizó tinción por inmunofluorescencia para detectar la neovascularización como se describió anteriormente [29].

La actividad de migración de MC3T3-E1 (CRL-2593, ATCC, EE. UU.) se determinó mediante Transwell y ensayos de heridas por raspado in vitro. Los procedimientos experimentales fueron los mismos que los anteriores. Se cocultivaron células MC3T3-E1 (5 x 104 células por pocillo) con medio de macrófagos acondicionado y medio completo (1:1), en el que se incluían 10 mmol/l de sal disódica de β-glicerofosfato, 50 μg/ml de ácido ascórbico y 10 nmol/L dexametasona. La tinción con ALP se realizó con el kit de tinción BCIP/NBT según el protocolo del fabricante. El día 14, las muestras de células fijadas se sumergieron en una solución de ARS para la tinción con ARS. Las células se incubaron conjuntamente con cloruro de cetilpiridinio al 10% durante 30 minutos con agitación. Después de la centrifugación durante 15 minutos, el sobrenadante recogido de cada muestra se midió a una longitud de onda de 562 nm. Después de cocultivar durante 7 días, las células se fijaron y se incubaron con suero de cabra al 5%. Luego, las muestras se incubaron con anticuerpos objetivo primarios contra el factor de transcripción 2 relacionado con Runt (Runx2; D1L7F, señalización celular) y osteopontina (OPN; 22952–1-AP, ProteinTech). Después de la incubación con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y la contratinción con DAPI, se observaron con CLSM (TCS SP8, Leica, Alemania).

Los niveles de expresión de Runx2, colágeno tipo I (Col-1), OPN y osteocalcina (OCN) en células MC3T3-E1 se examinaron con qRT-PCR. Brevemente, se aisló el ARN total de las células y se sintetizó el ADNc utilizando un kit de transcripción inversa HiScript III RT SuperMix. Los cebadores directos e inversos para los genes seleccionados también se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1.

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (No. ZN2022282). Como se muestra en la Fig. 1b, se construyó un modelo animal con lesión por defecto óseo del cráneo. Treinta y seis ratas macho (200–220 g) se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: control, CG, CG/PHA y CG/PHA/5%PBT. El diagrama de flujo de experimentos con animales y las pruebas correspondientes se muestran en el archivo adicional 2: Fig. S1. Dos semanas después de la cirugía, se sacrificaron 3 ratas de cada grupo utilizando un exceso de pentobarbital sódico, y se recogió la mitad del hueso de la calvaria y se fijó en paraformaldehído al 4% durante 48 h a 4 °C para su posterior análisis. Luego, las muestras se descalcificaron sumergiéndolas en EDTA al 10% durante aproximadamente 4 semanas a 37 °C. Después de incrustarlos en parafina, se cortó el área del defecto óseo que contenía las membranas para preparar secciones de parafina con un espesor de 5 µm. Para evaluar la respuesta inflamatoria local en la etapa inicial después de la implantación, se seleccionaron iNOS y CD206 como marcadores específicos para la tinción de inmunofluorescencia doble marcada para observar el fenotipo de los macrófagos infiltrantes. Además, se realizó una tinción inmunohistoquímica para el factor proinflamatorio TNF-α y la citoquina antiinflamatoria IL-10 para evaluar las propiedades antiinflamatorias del hidrogel piezoeléctrico durante la curación ósea. Se realizaron además tinciones inmunohistoquímicas e inmunofluorescentes para el factor de proangiogénesis VEGF/CD31 y la proteína morfogenética ósea 2 de la citocina de diferenciación proosteogénica (BMP-2)/Runx2 para evaluar la vascularización y la diferenciación osteogénica de las muestras mediante el tratamiento con hidrogel piezoeléctrico durante el tratamiento óseo. cicatrización.

Ocho semanas después de la cirugía, se sacrificaron 3 ratas en cada grupo como se mencionó anteriormente, y se escaneó todo el hueso calvarial mediante un sistema micro-CT (sistema SkyScan 1276, Bruker, Alemania) con las siguientes configuraciones: voltaje, 200 kV; corriente, 65 μA; y filtración, aluminio de 0,25 mm con un tamaño de píxel de imagen de 6,5 μm. El volumen de tejido óseo/volumen de tejido total (BV/TV) y la densidad mineral ósea (DMO) se analizaron en función de las imágenes de micro-CT reconstruidas. Se sacrificaron las últimas 3 ratas y se recogieron las muestras para análisis histológico. Las muestras de tejido se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) para evaluar la capacidad de reparación ósea. Posteriormente, se realizaron tinciones tricrómicas de Masson y tinciones tricrómicas de Goldner para visualizar la maduración del tejido óseo regenerado en el área del defecto. Para la tinción tricrómica de Masson, las áreas rojas se consideraron colágeno mineralizado (matriz ósea madura), mientras que las áreas azules se consideraron colágeno no mineralizado (matriz ósea inmadura). Para la tinción tricrómica de Goldner, las áreas teñidas de naranja/rojo se consideraron osteoides (hueso inmaduro), mientras que las áreas teñidas de verde oscuro se consideraron hueso mineralizado (hueso maduro). Además, la osteogénesis in vivo y la vascularización en los defectos óseos se analizaron mediante tinción inmunohistoquímica de Col-1, Runx2, OPN, CD31 y CD34 como se describió anteriormente [32]. Se tomaron imágenes de todas las muestras teñidas con un microscopio y se semicuantificaron mediante el software ImageJ.

Todos los experimentos en este trabajo se realizaron al menos tres veces. Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) y los gráficos se elaboraron con el software Origin 2018 (Origin Lab Corporation, EE. UU.). Los análisis se realizaron con la prueba t de Student (no pareada y de dos colas), ANOVA unidireccional o bidireccional, seguida de Tukey post hoc. El valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Como se muestra en las Figs. 1a y 2a, se fabricó un andamio de hidrogel piezoeléctrico poroso dopando HA cerámico modificado con PDA y nanopartículas piezoeléctricas de BaTiO3 en hidrogeles CG. El hidrogel CG que contenía un 10% p/p de nanopartículas de HA modificadas con PDA se denominó CG/PHA. Los hidrogeles CG que contienen 10% p/p de nanopartículas de HA modificadas con PDA y 5% p/p o 10% p/p de nanopartículas de BaTiO3 modificadas con PDA se denominaron CG/PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT, respectivamente. . El hidrogel CG presentó una superficie lisa, y la superficie de los hidrogeles con HA incorporado y nanopartículas piezoeléctricas de BaTiO3 mostró la presencia de nanopartículas. La rugosidad de la superficie de los hidrogeles aumentó con el aumento del número de nanopartículas, pero la porosidad del hidrogel no cambió. Para resolver el problema de la dispersión de nanopartículas, las nanopartículas de HA y BaTiO3 piezoeléctricas se modificaron con PDA. Una capa que recubre la superficie de las nanopartículas de BaTiO3 se puede ver claramente mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (archivo adicional 2: Fig. S2). Según la Fig. 2b, el mapeo de espectroscopía de dispersión de energía (EDS) de la muestra CG/PHA/5% PBT dopada con nanopartículas de HA (10% p/p) y nanopartículas piezoeléctricas de BaTiO3 (5% p/p) mostró que los elementos especiales (Ca y P presentes en HA; Ba y Ti presentes en BaTiO3) se distribuyeron uniformemente, lo que indica que las nanopartículas de HA y BaTiO3 piezoeléctricas se distribuyeron uniformemente en el hidrogel sin enfocar. Debido a la introducción de nanopartículas de HA en los hidrogeles, se pudo observar un pico característico en 2θ = 31,7 ° (Fig. 2c). El pico característico se asignó a los (211) planos de reflexión y fue consistente con la fase HA informada (Tarjeta JCPDS No. 01–74-0566). Además, para la curva de difracción de PHA/PBT, los picos de división en aproximadamente 45,4° pertenecían a los planos (002) para la fase tetragonal de BaTiO3 (Tarjeta JCPDS No. 05-0626), lo que demostró sus propiedades ferroeléctricas/piezoeléctricas [33 ]. Además, la intensidad de los picos aumentó al aumentar el contenido de PBT en los hidrogeles. Los espectros FTIR de los hidrogeles piezoeléctricos se muestran en la Fig. 2d. Estaba claro que la banda de 1272 cm-1 se asignó al estiramiento C-O-C, que podría atribuirse a los componentes Cs y Gel. En comparación con el hidrogel CG, la banda de absorción ubicada a 1510 cm −1 correspondió a la vibración de corte de N – H (Fig. 2d), lo que implica la presencia de PDA [34].

Caracterización de los hidrogeles piezoeléctricos. a Imágenes SEM representativas de diferentes muestras de hidrogel, las flechas rojas representan nanopartículas piezoeléctricas. b Mapeo elemental EDS del hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT. XRD (c), FTIR (d), curva reológica (e) y módulo de elasticidad (f) de diferentes muestras de hidrogel. g El voltaje de salida de diferentes muestras de hidrogel bajo 10 Hz y 1 kP de presión. *P < 0,05, en comparación con el grupo CG; #P < 0,05, en comparación con el grupo CG/PHA. Chitosán/gelatina CG, hidroxiapatita recubierta de polidopamina PHA, titanato de bario recubierto de polidopamina PBT, microscopio electrónico de barrido SEM, espectroscopia de dispersión de energía EDS, difracción de rayos X XRD, espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier FTIR

El módulo de almacenamiento de los hidrogeles piezoeléctricos CG, CG/PHA, CG/PHA/5% PBT y CG/PHA/10% PBT fue 342,8, 408,4, 493,1 y 532,2 Pa, respectivamente (Fig. 2e, f). Con la relación de peso incremental de las nanopartículas de HA y BaTiO3, el módulo de almacenamiento (G′) de los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT aumentó (P <0,05), lo que puede deberse a la regulación positiva de la densidad de reticulación en el Hidrogeles CG/PHA/PBT. Para detectar el rendimiento de generación de electricidad de los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT, se realizó una prueba de salida de voltaje. Todos los hidrogeles compuestos mostraron una cierta capacidad de generación (Fig. 2g), y la salida de voltaje de los hidrogeles CG, CG/PHA, CG/PHA/5% PBT y CG/PHA/10% PBT fue de aproximadamente 0,2, 0,25, 0,6 y 0,8 V, respectivamente. Las características de generación de electricidad de los hidrogeles CG/PHA con 5 a 10% en peso de BaTiO3 reflejaron una mayor capacidad para autogenerar electricidad. Como se demuestra en la Fig. 1c, el posible mecanismo autoalimentado subyacente a la señal piezoeléctrica en los hidrogeles CG/PHA/PBT se puede describir de la siguiente manera. Los dipolos de las nanopartículas de BaTiO3 están orientados en la misma dirección que los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT. La polarización eléctrica se presenta en la dirección de los dipolos orientados y puede producir un potencial piezoeléctrico en las nanopartículas piezoeléctricas de BaTiO3. En ausencia de estímulos externos, existe un equilibrio de carga positivo y negativo en el hidrogel. Una vez que se aplica un estímulo de presión/deformación a los hidrogeles piezoeléctricos, los electrones de los hidrogeles fluyen fuera del hidrogel. Una vez que desaparece la presión/deformación, las cargas libres acumuladas regresan a los hidrogeles piezoeléctricos. Durante esta serie de acciones se puede observar una corriente positiva y otra negativa. Si se aplica y libera continuamente un estímulo de fuerza (permitiendo que el gel vuelva a su volumen original), se observará una señal eléctrica sinusoidal típica, como se ilustra en la figura 2g.

Estos resultados indican la síntesis exitosa de un material de andamio de hidrogel con propiedades piezoeléctricas. Este material de andamio puede proporcionar una estimulación eléctrica eficaz bajo presión externa y formar un buen microambiente eléctrico para la regeneración de tejidos.

Durante el proceso de curación ósea, la inflamación, el estrés oxidativo, la angiogénesis y la osteogénesis están estrechamente relacionados. La inmunorreacción de primera etapa después de la inclusión del andamio es extremadamente importante para la reparación del tejido óseo. Las inmunorreacciones demasiado prolongadas durante el proceso de reparación ósea retrasan la regeneración ósea, lo que eventualmente conduce a la pseudoartrosis. Además, la transformación de los fenotipos de los macrófagos durante la inflamación afecta la cascada de eventos posterior, que determina el destino de los armazones implantados. La Figura 3a muestra cómo cocultivar los hidrogeles piezoeléctricos con macrófagos y representa los cambios fenotípicos y los efectos inmunomoduladores de los macrófagos bajo la influencia de los hidrogeles piezoeléctricos. Antes de realizar los experimentos con células, se determinó la citocompatibilidad de los hidrogeles piezoeléctricos con células RAW 264.7 con la prueba del kit CCK-8. Como se ve en la Fig. 3b, ningún grupo de extracto de hidrogel piezoeléctrico mostró efectos tóxicos en las células RAW 264.7 en diferentes momentos. La viabilidad celular de los grupos de extracto de hidrogel piezoeléctrico fue similar a la del grupo no tratado (P > 0,05). Para confirmar aún más los resultados de CCK-8, la apoptosis celular se analizó mediante tinción de células vivas/muertas (Fig. 3c, d). Tanto las imágenes bidimensionales (2D) como tridimensionales (3D) de células RAW 264.7 en los hidrogeles piezoeléctricos mostraron una alta tasa de supervivencia y ninguna célula apoptótica. Además, el comportamiento de migración de los macrófagos se pudo observar en cultivo 3D. Entre los cuatro grupos de materiales de soporte de hidrogel, las células RAW 264.7 en el grupo CG/PHA/5%PBT migraron más profundamente al vacío del hidrogel.

Evaluación in vitro de las propiedades inmunomoduladoras de los hidrogeles piezoeléctricos. a Diagrama esquemático de la regulación inmune por los hidrogeles piezoeléctricos. b Evaluación de la citocompatibilidad de los hidrogeles piezoeléctricos. Tinción c – d 2D y 3D de células vivas y muertas de macrófagos (células RAW 264.7) cocultivadas con hidrogeles piezoeléctricos. Barra de escala: 200 μm (c), 100 μm (d). e Imágenes representativas de inmunofluorescencia de células RAW 264.7 en hidrogeles. La actina F (verde) es una actina fibrosa que presenta el esqueleto de las células, F4/80 (rojo) es la glicoproteína de la superficie celular y el marcador de macrófagos maduros de ratón, DAPI (azul) representa el núcleo. Barra de escala: 25 μm. f Gráficos de puntos de citometría de flujo representativos que muestran marcadores de superficie celular de células RAW 264.7, incluidas CD86 y CD206. g Imágenes de inmunofluorescencia representativas de iNOS (rojo) y CD206 (verde) en células RAW 264.7 en hidrogeles el día 2. Barra de escala: 25 μm. h Niveles relativos de expresión de ARNm de genes antiinflamatorios y genes proinflamatorios de macrófagos bajo la estimulación de hidrogeles piezoeléctricos durante 2 días. *P < 0,05, en comparación con el grupo de control; #P < 0,05, en comparación con el grupo CG; $P < 0,05, en comparación con el grupo CG/PHA; @P < 0,05, en comparación con el grupo CG/PHA/5%PBT. CG quitosano/gelatina, PHA hidroxiapatita recubierta de polidopamina, PBT titanato de bario recubierto de polidopamina, IL-6 interleucina-6, TNF-α factor de necrosis tumoral-α, óxido nítrico sintasa inducible por iNOS, IL-4 interleucina-4, IL- 10 interleucina-10, Arg1 arginasa 1

Se estudiaron las propiedades inmunomoduladoras de los hidrogeles piezoeléctricos. La Figura 3e muestra la tinción por inmunofluorescencia de actina F y F4/80 en células RAW 264.7 en soportes de hidrogel piezoeléctrico. Las imágenes de inmunofluorescencia con doble marcado F-actina y F4/80 mostraron que los macrófagos se adhirieron a la superficie del hidrogel CG, y las células del grupo control presentaban una forma de huevo frito con muchos filopodios, mientras que las del grupo CG/PHA El grupo tenía una típica apariencia redonda. Además, los macrófagos adheridos a la superficie de los grupos CG/PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT adoptaron una forma fusiforme. Los resultados del área de extensión celular y la proporción de células fusiformes mostraron que los macrófagos en los grupos CG y control presentaron una morfología similar a M1 y un área de extensión grande, mientras que los macrófagos en los grupos CG/PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT exhibió una forma fusiforme, que se considera típica del fenotipo M2. Por lo tanto, los efectos inmunomoduladores de los hidrogeles piezoeléctricos causaron una mayor propensión a la activación de macrófagos de tipo M2 en los grupos de hidrogel piezoeléctricos que en los grupos de hidrogel no piezoeléctricos.

Además, se utilizó citometría de flujo para evaluar la polarización de los macrófagos. Las proporciones de células CD86 positivas de los grupos control, CG, CG/PHA, CG/PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT fueron 21,7%, 21,4%, 20,0%, 8,8% y 11,9%, respectivamente. Las proporciones de células CD206 positivas de los grupos control, CG, CG/PHA, CG/PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT fueron 9,9%, 10,6%, 13,5%, 21,1% y 17,7%, respectivamente (Fig. 3f, archivo adicional 2: Fig. S3a). La tinción por citometría de flujo y los resultados cuantitativos mostraron que los hidrogeles piezoeléctricos redujeron significativamente la expresión de CD86 (un marcador de superficie de macrófagos M1) y mejoraron la expresión de CD206 (un marcador de superficie de macrófagos M2) (P <0,05). Se observó una mayor expresión de CD86 en los grupos control, CG y CG/PHA que en los macrófagos expuestos a los grupos CG/PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT. Mientras tanto, el número de macrófagos CD206+ M2 aumentó en los grupos CG/PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT en comparación con los grupos control, CG y CG/PHA (P <0,05; archivo adicional 2: Fig. S3a). Los resultados de inmunofluorescencia y transferencia Western fueron similares a los de la citometría de flujo (Fig. 3g, archivo adicional 2: Fig. S3b).

Para investigar el perfil de citocinas, se realizaron experimentos de RT-qPCR (Fig. 3h). Los resultados de RT-qPCR mostraron una importante regulación negativa de las citocinas proinflamatorias, como IL-6, TNF-α, iNOS y CD86, en los grupos CG/PHA/5%PBT y CG/PHA/10%PBT. (P<0,05). Mientras tanto, la expresión de marcadores de genes antiinflamatorios (IL-4, IL-10, Arg1 y CD206) se reguló significativamente en estos grupos en comparación con los grupos CG/PHA, CG y control (P <0,05). Además, la secreción de BMP-2, TGF-β1, VEGF y bFGF ilustró que el microambiente eléctrico elevó los efectos de acomodación al acelerar la secreción de citocinas pro-regeneración por parte de los macrófagos (P <0,05, archivo adicional 2: Fig. S4).

Los resultados anteriores sugieren que las señales eléctricas y el microambiente eléctrico proporcionados por los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT podrían regular la inmunidad y promover la polarización de los macrófagos M2 y la secreción de citoquinas antiinflamatorias y curativas por parte de los macrófagos. Dado que el rendimiento biológico del hidrogel CG/PHA/5%PBT fue mejor que el del hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/10%PBT, nos centramos en el hidrogel CG/PHA/5%PBT en experimentos posteriores.

Para estudiar la respuesta quimiotáctica de las HUVEC al medio de cocultivo del cocultivo de macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos, se realizaron ensayos de migración de Transwell y curación de heridas por raspado. Como se muestra en las figuras 4a-c y en el archivo adicional 2: figura S5, el medio de cocultivo promovió la migración y la infiltración de HUVEC. Estos cambios de comportamiento son muy beneficiosos para la angiogénesis durante la curación y reparación ósea [35, 36]. La capacidad de migración de HUVEC en los grupos CG, CG/PHA y CG/PHA/5%PBT fue mayor que en el grupo control (P < 0,05), debido a que el medio de cocultivo de macrófagos y CG, CG/PHA y Los hidrogeles CG/PHA/5%PBT tuvieron un efecto positivo en la migración celular. Es probable que esto se deba a que estos hidrogeles pueden promover la secreción de BMP-2, VEGF y bFGF en macrófagos (archivo adicional 2: Fig. S4). El medio de cocultivo de macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/5% PBT tuvieron el mejor efecto con respecto a promover la migración e infiltración de HUVEC. Los hidrogeles piezoeléctricos muestran un potencial sustancial para la angiogénesis ósea en la regeneración ósea. Estos datos indican que los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/5%PBT pueden proporcionar un microambiente eléctrico excelente para la vascularización ósea.

Evaluación in vitro de la capacidad angiogénica de los hidrogeles piezoeléctricos. a Diagrama esquemático del experimento con células proangiogénicas. En primer lugar, el hidrogel piezoeléctrico se cultivó conjuntamente con macrófagos; luego, se cultivaron células endoteliales vasculares utilizando el medio de cocultivo de macrófagos. b Imágenes digitales y microscópicas representativas de las células HUVEC que migraron a la cámara inferior después de que el medio de macrófagos se agregó por separado a la cámara inferior y se cultivó durante 24 h. Barra de escala: 200 μm. c Imágenes microscópicas representativas de HUVEC después de que las células se cocultivaron con diferentes medios de macrófagos durante 24 h. Barra de escala: 200 μm. d Imágenes de fluorescencia representativas y análisis cuantitativo de la formación de tubos HUVEC después de que las células se cultivaron conjuntamente con diferentes medios de macrófagos durante 8 h. El porcentaje del área de los vasos sanguíneos es la densidad de los vasos de las células endoteliales vasculares en una sola imagen, el número total de uniones son las intersecciones celulares entre las células endoteliales vasculares en una sola imagen, la formación de tubos se cuantificó utilizando AngioTool (Instituto Nacional del Cáncer, NIH) para la porcentaje del área de los vasos sanguíneos y el número total de uniones. Barra de escala: 250 μm. e Niveles relativos de expresión de ARNm de genes relacionados con la angiogénesis en HUVEC después de que las células se cocultivaron con diferentes medios de macrófagos durante 7 días, incluidos VEGF, HIF-1α, bFGF y Ang-1. f Imágenes de inmunofluorescencia representativas de CD31 (rojo), VEGF (verde) y núcleos (azul) en HUVEC después de que las células se cultivaron conjuntamente con diferentes medios de macrófagos durante 7 días. Barra de escala: 25 μm. *P < 0,05, en comparación con el grupo de control; #P < 0,05, en comparación con el grupo CG; $ P < 0,05, en comparación con el grupo CG/PHA. CG quitosano/gelatina, hidroxiapatita recubierta de polidopamina PHA, titanato de bario recubierto de polidopamina PBT, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF, factor 1α inducible por hipoxia HIF-1α, factor de crecimiento de fibroblastos básico bFGF, angiopoyetina-1 Ang-1, vena umbilical humana HUVEC células endoteliales

La capacidad de formar vasos sanguíneos después de una lesión ósea juega un papel fundamental en la reconstrucción del tejido defectuoso óseo, ya que proporcionan sangre, nutrientes y oxígeno al tejido dañado y alivian las respuestas inflamatorias incontroladas en el sitio dañado [34, 37, 38]. Por lo tanto, se realizó un ensayo de formación de tubos Matrigel para evaluar la capacidad de los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/PBT para promover la formación de nuevos vasos. Las HUVEC cocultivadas con el medio de cocultivo de macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos mostraron más tubos vasculares (Fig. 4d). Sin embargo, se observaron algunas estructuras tubulares incompletas en los grupos CG y CG/PHA. El porcentaje de área de vasos sanguíneos y el número total de uniones aumentaron significativamente en el grupo CG/PHA/5% PBT (P <0,05, Fig. 4d), lo que sugiere que los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/5% PBT combinados con macrófagos podrían promover la angiogénesis in vitro. Todos estos resultados indican que el medio de cocultivo de macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/5% PBT podrían promover la migración de HUVEC y la formación de vasos sanguíneos.

Los genes VEGF, HIF-1α, bFGF y Ang-1 son genes relacionados con la angiogénesis cuyo perfil de expresión está estrechamente relacionado con la angiogénesis [31, 39]. Cuando las HUVEC se cultivaron conjuntamente con medio de cocultivo de macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos, el grupo CG/PHA/5%PBT mostró una expresión significativamente regulada por aumento de estos genes en comparación con los grupos control, CG y CG/PHA (P <0,05, Fig. 4e), lo que sugiere que el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/PBT tenía una buena bioactividad angiogénica in vitro. La expresión más alta de los genes relacionados con la angiogénesis se observó en el grupo CG/PHA/5%PBT, seguido por los grupos CG/PHA, CG y control. No hubo diferencias significativas entre los grupos de control y CG (P > 0,05). La tinción de inmunofluorescencia doble de CD31 y VEGF se realizó adicionalmente después de 1 semana de cocultivo para evaluar el efecto angiogénico del hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT. Como se demuestra en la Fig. 4f, la expresión de CD31 y VEGF en HUVEC en el grupo CG/PHA/5% PBT fue significativamente mayor que en los grupos control, CG y CG/PHA. Los resultados de la tinción de inmunofluorescencia fueron consistentes con el análisis de RT-qPCR. Por lo tanto, la regulación del microambiente inmunológico mediante hidrogel piezoeléctrico puede promover eficazmente la angiogénesis.

Para evaluar el efecto del medio de cocultivo de macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos sobre los osteoblastos, se realizaron muchas evaluaciones de funciones biológicas, como migración celular, osteodiferenciación y mineralización de la matriz extracelular (MEC) (archivo adicional 2: Fig. S6a). Se utilizaron ensayos de curación de heridas de Transwell y de raspado para analizar la migración de células de osteoblastos (MC3T3-E1) tratadas con medio de cocultivo de macrófagos y hidrogeles piezoeléctricos. Como se muestra en el archivo adicional 2: Fig. S6b-c, la migración de células MC3T3-E1 fue mayor en el grupo CG/PHA/5% PBT, mientras que la migración en los grupos CG y CG/PHA fue ligeramente mayor que en el grupo de control (P < 0,05). Estos datos revelaron que los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/5%PBT podrían estimular la migración de las células MC3T3-E1.

La diferenciación osteogénica de las células MC3T3-E1 en el medio de cocultivo de macrófagos y hidrogeles piezoeléctricos se evaluó mediante tinción con ALP, tinción con ARS, ensayo de RT-qPCR y tinción por inmunofluorescencia. La ALP es un bioindicador de diferenciación osteogénica en las etapas iniciales y se utilizó para evaluar la diferenciación mediante tinción y evaluación cuantitativa. Las fotografías que se muestran en el archivo adicional 2: Fig. S6d indican que el medio de cocultivo de macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/5% PBT mostraron la tinción de ALP y la actividad de ALP más intensificadas en los días 7 y 14 en comparación con el otros tres grupos (P < 0,05). Se aplicó tinción ARS para examinar el estado de mineralización de diferentes grupos de tratamiento. Como se demuestra en el archivo adicional 2: Fig. S6e, todas las células se adhirieron al medio osteoinductivo y al medio de cocultivo de los macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos, mostrando resultados de tinción positivos el día 14 y el día 21. El grupo CG/PHA/5%PBT expresó la mejor capacidad osteogénica. Se midieron los valores de DO para evaluar cuantitativamente la tinción con ARS utilizando un lector de microplacas a 562 nm; los resultados fueron consistentes con los de la microscopía óptica.

Además, se evaluó la expresión de genes osteogénicos, como Runx2, Col-1, OPN y OCN, para validar la diferenciación proosteogénica de células MC3T3-E1 en el medio de cocultivo de macrófagos y hidrogeles piezoeléctricos. Como se demuestra en el archivo adicional 2: Fig. S6f, se detectó una expresión altamente regulada por aumento de estos genes en el grupo CG/PHA/5% PBT en relación con la del control (placas de 24 pocillos), CG y CG/PHA. grupos el día 14 (P < 0,05). La tinción por inmunofluorescencia también confirmó que las células MC3T3-E1 cultivadas en el medio de cocultivo de macrófagos y los hidrogeles piezoeléctricos expresaron niveles más altos de proteínas Runx2 y OPN que otros grupos (archivo adicional 2: Fig. S6g). Todos estos hallazgos demuestran que los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/5%PBT poseían una capacidad satisfactoria para promover la diferenciación osteogénica de las células MC3T3-E1.

En cuanto al rendimiento biológico, los hidrogeles piezoeléctricos mejoraron profundamente la osteogénesis e indujeron eficazmente el cambio de macrófagos proinflamatorios M1 al fenotipo antiinflamatorio M2 a través de múltiples propiedades bioquímicas y biofísicas. Para evaluar más a fondo la aplicabilidad de los hidrogeles piezoeléctricos para la reparación ósea, preparamos un modelo de defecto de cráneo de rata de acuerdo con un método descrito previamente [18]. Los hidrogeles (hidrogeles piezoeléctricos CG, CG/PHA y CG/PHA/5% PBT) se implantaron en los sitios de defecto. Las ratas que no recibieron ningún hidrogel formaron el grupo de control en blanco. Los hidrogeles piezoeléctricos implantados en los sitios de lesión ósea podrían construir una barrera en estos sitios. La neovascularización posterior en el sitio del defecto finalmente condujo a una regeneración ósea de gran tamaño.

La polarización de los macrófagos en los sitios del defecto se detectó mediante tinción inmunohistoquímica 2 semanas después de la implantación. Como se muestra en el archivo adicional 2: Fig. S7a, el defecto del tejido óseo in situ reveló una menor proporción de células iNOS positivas y una mayor proporción de células CD206 positivas en el grupo CG/PHA/5% PBT, lo que indica el desarrollo de una respuesta antiinflamatoria tras la implantación de los hidrogeles piezoeléctricos. El TNF-α, un factor proinflamatorio común, y la IL-10, un factor antiinflamatorio, están estrechamente relacionados con la reacción inflamatoria en el sitio lesionado. Por lo tanto, se realizaron ensayos inmunohistoquímicos para TNF-α e IL-10 para investigar la reacción inflamatoria inicial en el proceso de reparación ósea. En comparación con los grupos CG, CG/PHA y CG/PHA/5%PBT, el factor proinflamatorio TNF-α fue significativamente mayor en el grupo de control. Por el contrario, el factor antiinflamatorio IL-10 estaba regulado positivamente en el grupo CG/PHA/5%PBT (archivo adicional 2: Fig. S7b). Estos datos confirmaron que el hidrogel CG/PHA/5%PBT era más propicio para el cambio de macrófagos de M1 a M2 que los armazones de hidrogel CG y CG/PHA.

Al regular la polarización M1 a M2 de los macrófagos, se puede remodelar eficazmente la respuesta inflamatoria que rodea la regeneración ósea in situ. También debe iniciarse la regeneración del tejido óseo tras la regulación inmunitaria. VEGF y BMP-2 funcionan como potentes inductores de angiogénesis y osteogénesis y siempre son secretados por macrófagos M2 en la etapa de vascularización ósea [40]. Para verificar el papel del hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/PBT en la inducción de angiogénesis y osteogénesis, se realizó un análisis inmunohistoquímico de VEGF y BMP-2 2 semanas después de la cirugía. Se observó una mayor expresión de VEGF y BMP-2 en el grupo CG/PHA/5% PBT (archivo adicional 2: Fig. S7b), lo que demuestra un mayor potencial para facilitar la vascularización y la formación ósea. Además, también se realizó tinción de inmunofluorescencia de CD31 y Runx2 2 semanas después de la cirugía para explorar las capacidades angiogénicas y osteogénicas de los hidrogeles piezoeléctricos. Se observó una mayor expresión de CD31 y Runx2 en el grupo CG/PHA/5% PBT (archivo adicional 2: Fig. S7c), lo que demuestra un mayor potencial para facilitar la vascularización y la remodelación ósea. Las señales eléctricas producidas por los hidrogeles piezoeléctricos podrían ser efectivas para la transformación del fenotipo M1 del macrófago al fenotipo M2 al mejorar la expresión de VEGF, CD31, BMP-2 y Runx2, lo que podría crear un microambiente acomodativo para la diferenciación osteogénica y la inmunomodulación. Por lo tanto, el microambiente inmunorregulador óseo inducido por hidrogeles piezoeléctricos puede diferenciar las células madre mesenquimales endógenas (MSC) en osteoblastos y permitirles lograr una rápida regeneración ósea. En conclusión, el hidrogel piezoeléctrico mostró una capacidad considerable para facilitar la reparación del hueso craneal.

Para probar sistemáticamente la osteogénesis inducida por el hidrogel piezoeléctrico en un perfil largo, el hueso recién formado se escaneó mediante micro-CT. En la Fig. 5a, los huesos del cráneo lesionados a los que se aplicaron los hidrogeles piezoeléctricos mostraron una mejor reparación que el grupo de control tanto 4 como 8 semanas después de la implantación (P <0,05). Los datos mostraron que se formó mucho más hueso nuevo después de la implantación de hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT en comparación con los grupos control, CG y CG/PHA (P <0,05). Ocho semanas después de la implantación, el BV/TV del grupo CG/PHA/5%PBT [(35,4 ± 4,1)%] fue significativamente mayor que el del grupo CG/PHA [(24,3 ± 5,2)%] y el grupo CG [ (15,8 ± 3,7)%] (P < 0,05). Los sitios implantados con el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT también mostraron hueso más maduro con una mayor densidad (P <0,05). Los datos de BMD mostraron las mismas tendencias que los resultados de BV/TV. En conjunto, el comportamiento osteogénico mejorado de los hidrogeles piezoeléctricos CG/PHA/5%PBT se demostró en experimentos con células, y su mejora en la capacidad de remodelación ósea favorable a la curación también se verificó en un modelo de rata.

El hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT promueve la regeneración del tejido óseo in vivo. Imágenes coronales y sagitales de micro-CT 2D, y los resultados de BV/TV y BMD de tejidos óseos regenerados. Barra de escala: 200 μm. b Tinción con HE, tricrómico de Masson y tricrómico de Goldner del defecto óseo 8 semanas después de la implantación. Barra de escala: 200 μm. Las flechas amarillas y las flechas negras representan el canal central recién formado y las lagunas óseas dentro de la región del defecto, respectivamente. Para las imágenes de tinción tricrómica de Goldner, se detectó una pequeña isla de hueso inmaduro (osteide, rojo) en la periferia del sitio del defecto en el grupo de control. Las líneas de puntos negros definen el límite del defecto óseo craneal de tamaño crítico. *P < 0,05, en comparación con el grupo de control; #P < 0,05, en comparación con el grupo CG; $P < 0,05, en comparación con el grupo CG/PHA. CG quitosano/gelatina, hidroxiapatita recubierta de polidopamina PHA, titanato de bario recubierta de polidopamina PBT, volumen de tejido óseo BV/TV/volumen de tejido total, densidad mineral ósea DMO, tejido fibroso FT, tejido óseo recién formado NB, hueso huésped HB, MB mineralizado /hueso maduro

Luego se realizaron tinciones histológicas, incluida la tinción HE, la tinción tricrómica de Masson y Goldner, para evaluar si el hidrogel piezoeléctrico podría mejorar la formación ósea in vivo a las 8 semanas (Fig. 5b). Cuando se incrustó el hidrogel piezoeléctrico durante 8 semanas, el tejido de cambium en el grupo de control era principalmente tejido fibroso grueso, con una pequeña cantidad de hueso nuevo disperso y discontinuo. Por el contrario, las imágenes histológicas demostraron tejidos óseos mucho más densos en el grupo CG/PHA/5%PBT que en los grupos control, CG y CG/PHA 8 semanas después de la implantación. Como era de esperar, el grupo CG/PHA/5%PBT tuvo la mayor cantidad de formación de matriz ósea entre todos los grupos experimentales y mostró una excelente regeneración ósea 8 semanas después del trasplante. El grupo CG/PHA/5%PBT no solo regeneró las nuevas lagunas óseas y el hueso laminar rodeado por el canal central, sino que el hueso laminar también se expandió hacia el centro del defecto óseo para formar una estructura ósea más completa. Este resultado proporciona evidencia histológica de que la estimulación piezoeléctrica continua proporcionada por el hidrogel CG/PHA/5%PBT después de la implantación reclutó MSC en el sitio lesionado y promovió su diferenciación en osteoblastos. En particular, la superficie superior del grupo CG/PHA/5%PBT se cubrió con una fina capa de tejido reparador 8 semanas después de la implantación, lo que sugiere la compatibilidad favorable y la biodegradabilidad a largo plazo de nuestro hidrogel piezoeléctrico fabricado in vivo. La tinción roja en la tinción tricrómica de Masson representa el colágeno mineralizado y la matriz ósea madura, mientras que la tinción azul representa el colágeno no mineralizado y la matriz ósea inmadura. En este estudio, el grupo CG/PHA/5%PBT mostró abundante tinción roja, lo que indica que el cráneo regenerado en el grupo de hidrogel se estaba calcificando y que gran parte de él había madurado. En la tinción tricrómica de Goldner, la tinción verde oscuro representa el hueso laminar maduro y la tinción roja representa el hueso tejido inmaduro (osteoides). Los resultados de la tinción tricrómica de Goldner fueron consistentes con los resultados de la tinción tricrómica de Masson. Inesperadamente, el hueso recién formado en el grupo CG/PHA/5%PBT era similar al hueso original. Con todo, los resultados de tinción histoquímica anteriores indican que los hidrogeles piezoeléctricos tienen una capacidad osteopromotora preeminente.

Posteriormente, se realizó una tinción inmunohistoquímica de Col-1, Runx2, OPN, CD31 y CD34 (biomarcadores relacionados con la osteogénesis y la angiogénesis) para evaluar la osteogénesis y la angiogénesis in vivo. Como se muestra en el archivo adicional 2: Fig. S8, fue difícil observar tinción de proteínas positiva en la región defectuosa de los grupos de control y CG a las 8 semanas, mientras que se observaron muchas manchas de tinción marrón y/o marrón rojizo en el CG. /PHA/5%PBT, lo que indica que el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT podría acelerar la expresión de genes relacionados con la osteogénesis y la angiogénesis. La expresión de estas proteínas puede activar continuamente la osteogénesis, la angiogénesis y el depósito de ECM. La alta expresión de Col-1, Runx2, OPN, CD31 y CD34 indicó que los defectos óseos cubiertos con el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT conservaban una excelente capacidad osteogénica y angiogénica.

Tras los análisis in vitro e in vivo, se determinó mediante secuenciación de ARN el mecanismo molecular subyacente al efecto del tratamiento con hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5% PBT en los macrófagos. Se obtuvo un total de 2069 genes expresados ​​diferencialmente (DEG), incluidos 1013 genes regulados positivamente y 1056 genes regulados negativamente, entre el grupo CG / PHA / 5% PBT y el grupo CG (Fig. 6a). El mapa de calor de los DEG asociados con la regulación inmune demostró que los genes antiinflamatorios y pro-curativos, como Arg1, Vegfa, Tgfb1, Il10, Trem1, Mapk12, Hspa1a, Hspa1b, Cd209a, Cxcl2, Ccl3, E2f7, Cd163, Ccl4, Pbk , Il4, Mrc1 y Spp1 se sobreexpresaron, mientras que la diferenciación de osteoclastos se reguló negativamente en el grupo CG/PHA/5% PBT (P <0,05, Fig. 6b). Los genes proinflamatorios, como Nos2, Il6, IL1b, Tnf, Cxc11 y CD86, estaban regulados negativamente en el grupo CG/PHA/5% PBT (P <0,05, Fig. 6b). La base de datos KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) es un sitio web basado en bioinformática de uso común para el análisis de la función genética. En este estudio, se agruparon un total de 11.729 unigenes en 258 vías conocidas en la base de datos KEGG. Los resultados de la vía KEGG demostraron que las vías de señalización relacionadas con el sistema inmunológico estaban sobreexpresadas, como la vía de señalización PI3K-Akt, la vía de señalización MAPK, la vía de señalización de quimiocinas, el procesamiento y presentación de antígenos, la vía de señalización AMPK y la vía de señalización del receptor de células B (Fig. 6c). Gene Ontology (GO) es otro sistema para la categorización de genes. Según los resultados de la detección, se clasificaron 11.729 unigenes y se dividieron en tres categorías: función molecular, componente celular y proceso biológico. Estos unigenes se dividieron en 58 subcategorías (archivo adicional 2: Fig. S9a). El análisis de enriquecimiento del proceso biológico mostró que los genes relacionados con la respuesta inmune estaban estrechamente relacionados (Fig. 6d). En la categoría de componentes celulares, el aparato de Golgi fue el unigene más expresado (archivo adicional 2: Fig. S9b). Dentro de la categoría de función molecular, las cinco subcategorías más abundantes fueron la unión a ATP, la unión a proteínas idénticas, la unión, la unión a complejos macromoleculares y la unión a proteína quinasa (archivo adicional 2: Fig. S9c). Según el análisis GO, suponemos que el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT podría regular la respuesta inmune basada en macrófagos. La función principal del aparato de Golgi es procesar, clasificar y transportar proteínas sintetizadas por el retículo endoplasmático y luego enviarlas a partes específicas de la célula o secretarlas fuera de la célula. Por tanto, la polarización de los macrófagos está estrechamente relacionada con el metabolismo del aparato de Golgi. A nivel molecular, el proceso de polarización de los macrófagos implica el metabolismo energético y la unión dinámica a la membrana.

Análisis del transcriptoma de la inmunidad de los macrófagos regulada por el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT. a Análisis cuantitativo de DEG en macrófagos de los grupos CG y CG/PHA/5%PBT. b Mapa de calor de DEG asociados con la regulación inmune. A1 – A5 son muestras de hidrogel CG y B1 – B5 son muestras de hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT. c Análisis de la vía KEGG en macrófagos de los grupos CG y CG/PHA/5%PBT. d Análisis de enriquecimiento de GO de los 20 procesos biológicos más diferencialmente regulados hacia arriba y hacia abajo. CG quitosano/gelatina, hidroxiapatita recubierta de polidopamina PHA, titanato de bario recubierto de polidopamina PBT, genes expresados ​​diferencialmente DEG, enciclopedia de genes y genomas de KEGG Kyoto, ontología de genes GO

Según los resultados de la secuenciación de ARN, la vía de señalización PI3K-Akt puede desempeñar un papel vital en la regulación de la polarización de los macrófagos M2. Dado que las proteínas fosforiladas se encuentran en un estado activo que regula las funciones celulares, utilizamos inmunohistoquímica para detectar los niveles de p-PI3K y p-Akt en tejidos óseos regenerados (archivo adicional 2: Fig. S10a). Los resultados mostraron que la expresión de las proteínas p-PI3K y p-Akt fue más alta en el grupo CG/PHA/5%PBT, seguida por los grupos CG/PHA y CG (P <0,05). Se puede inferir que el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT podría activar significativamente el eje de señalización PI3K/Akt para regular la polarización de los macrófagos M2. Con base en los resultados del experimento con animales, utilizamos el inhibidor de PI3K BEZ235 (0, 10, 100 y 200 ng/ml) para bloquear la vía de señalización de PI3K/Akt en macrófagos inoculados en los hidrogeles piezoeléctricos. Como se muestra en el archivo adicional 2: Fig. S10b, los macrófagos podrían cambiarse al fenotipo M1 agregando LPS (200 ng/ml) al sistema de cocultivo de hidrogeles piezoeléctricos y macrófagos. La IL-4, una citoquina antiinflamatoria, podría promover significativamente la polarización de los macrófagos tipo 2 a una concentración de 20 ng/ml. Por el contrario, BEZ235, un inhibidor de PI3K, podría inhibir significativamente la polarización M2 de los macrófagos. Cuando la concentración del inhibidor BEZ235 disminuyó a 0 ng/ml, el efecto inhibidor desapareció y los hidrogeles pudieron promover la polarización M2 de los macrófagos. Se ha informado que las integrinas y CD44 son elementos anteriores de la vía de señalización PI3K/Akt implicados en la polarización de los macrófagos [41]. Por lo tanto, en la Fig. 7 se propone un esquema hipotético del mecanismo por el cual el hidrogel piezoeléctrico CG / PHA / 5% PBT regula la polarización del macrófago M2.

Diagrama esquemático del posible mecanismo molecular mediante el cual el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT promueve la reparación ósea regulando la polarización de los macrófagos M2 y activando el eje PI3K/Akt. CG quitosano/gelatina, PHA hidroxiapatita recubierta de polidopamina, PBT titanato de bario recubierto de polidopamina, PI3K fosfoinositol 3 quinasa, Akt serina/treonina proteína quinasa

En el presente estudio, se construyó con éxito un andamio de hidrogel piezoeléctrico versátil CG/PHA/PBT para la ingeniería de tejido óseo. Este hidrogel piezoeléctrico no sólo genera electricidad de forma espontánea sino que también regula la inmunidad, la angiogénesis y la osteogénesis. Hemos razonado cuidadosamente el mecanismo subyacente a la electricidad espontánea de este hidrogel piezoeléctrico en la Fig. 1c, que puede explicar cómo crea un microambiente piezoeléctrico propicio para la regeneración in vivo. El efecto favorable a la formación de huesos de los hidrogeles piezoeléctricos se verificó mediante varios experimentos in vitro e in vivo. Además, identificamos la vía de señalización clave (eje PI3K/Akt) a nivel molecular mediante secuenciación del transcriptoma. Finalmente, volvimos a experimentos in vivo para verificar los cambios de expresión de las proteínas PI3K y Akt fosforiladas, así como a experimentos de inhibición in vitro para determinar sus funciones reguladoras. En conjunto, nuestros resultados muestran que el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/PBT autoalimentado podría regular la polarización de los macrófagos M2 mediante la creación de un microambiente piezoeléctrico, promoviendo así la angiogénesis y la osteogénesis y, en última instancia, la curación ósea.

El gel es una proteína soluble en agua que se produce procesando y desnaturalizando el colágeno, que es la principal proteína de la piel, tendones, huesos y otros tejidos [42]. Precisamente debido a su excelente solubilidad, el colágeno tiene malas propiedades mecánicas, lo que dificulta su uso únicamente en ingeniería de tejidos. Como resultado, el colágeno generalmente necesita combinarse con otros polímeros y reticularse químicamente antes de poder usarse en ingeniería de tejidos [43]. El Cs es un tipo de polisacárido catiónico natural que generalmente se obtiene por desacetilación del exoesqueleto de crustáceos e insectos [44]. Cuando el Cs se entrecruzó químicamente con el gel, las propiedades mecánicas del hidrogel CG mejoraron en gran medida [45, 46]. Prokhorov et al. [47] fabricaron un polímero piezoeléctrico CS-BT, los experimentos in vitro verificaron la posibilidad en ingeniería de tejidos. Zhang et al. [48] ​​desarrollaron suturas basadas en CG. Los experimentos in vivo demostraron que estas suturas basadas en CG pueden reducir la respuesta inflamatoria y promover la integración del tejido debido al efecto sinérgico de la estructura porosa y el recubrimiento bioactivo de la superficie, que tiene un gran potencial para su aplicación en la curación y remodelación funcional de los tendones. Parque y col. [49] han propuesto un amortiguador de hidrogel CG viscoelástico de material de filtro de cinta no convencional para eliminar selectivamente los artefactos de ruido mecánico dinámico. Los hidrogeles exhiben transiciones de fase dependientes de la frecuencia que resultan en un estado de goma que amortigua el ruido de baja frecuencia y un estado de vidrio que transmite la señal de alta frecuencia deseada. Los hidrogeles CG demostraron un filtro de paso adaptativo que captura señales de alta calidad de los pacientes y al mismo tiempo minimiza el procesamiento de señales en bioelectrónica avanzada.

En la actualidad, la mayoría de experimentos para mejorar la regeneración ósea se centran principalmente en los dos aspectos siguientes: 1) promover la diferenciación de los osteoblastos y 2) reducir el número y la actividad de los osteoclastos. La dirección actual de la investigación principal es mejorar la diferenciación de los osteoblastos, por ejemplo, aumentando los factores de crecimiento que se dirigen directamente a los osteoblastos, como BMP-2 y Runx2 [6, 50,51,52,53]. HA puede realizar la combinación de enlaces químicos con la interfaz del tejido óseo y tiene cierta solubilidad en el cuerpo humano. La liberación de iones puede participar en el metabolismo óseo del organismo y tiene un efecto estimulante e inductor de la hiperplasia ósea o la diferenciación osteogénica. Una gran cantidad de experimentos celulares y animales han demostrado que la HA tiene una actividad de diferenciación ósea superior [54, 55].

Las nanopartículas de BaTiO3 se han mostrado muy prometedoras en el campo de la ingeniería biomédica [9, 56, 57]. Kim y cols. [58] demostraron que BaTiO3 se puede utilizar para estimular el tejido profundo del cerebro mediante la producción de óxido nítrico (NO) y la generación de corriente eléctrica mediante ultrasonido. La liberación de NO podría romper temporalmente la barrera hematoencefálica y permitir que las nanopartículas de BaTiO3 se acumulen en el parénquima cerebral, y la corriente de salida piezoinducida estimula las células similares a las neuronas dopaminérgicas para que liberen dopamina. La aplicación de BaTiO3 puede provocar la remisión de los síntomas de la enfermedad de Parkinson sin toxicidad significativa. Liu y cols. [59] propusieron un hidrogel piezocatalítico BaTiO3 para promover la cicatrización de heridas infectadas por bacterias. El hidrogel compuesto BaTiO3 tiene un fuerte campo eléctrico interno y produce ROS debido a la presencia de nanopartículas de BaTiO3, que tienen excelentes efectos antibacterianos que ayudan a curar las heridas infectadas. Por tanto, las nanopartículas de BaTiO3 muestran grandes perspectivas de aplicación en el campo de la ingeniería biomédica debido a sus excelentes propiedades piezoeléctricas. Debido a la evaluación exhaustiva de las propiedades de Cs, Gel, HA y BaTiO3, utilizamos este complejo cuaternario para la investigación de la regeneración del tejido óseo.

El hidrogel BaTiO3 de este estudio funcionó como nanogeneradores y pudo generar una salida de voltaje de 0,8 V bajo una presión de 1 kPa. Sol y cols. [60] desarrollaron un nanogenerador piezoeléctrico de esponja de madera que generaba una salida de voltaje de 0,4 V bajo una presión de 4,4 kPa. Además, una serie de nanogeneradores de Cs acaba de generar una salida de voltaje de 0,06 V [61]. Por lo tanto, nuestro nanogenerador de hidrogel BaTiO3 exhibe un rendimiento autoalimentado excelente. En la medicina militar, el hidrogel piezoeléctrico no sólo podría usarse como soporte para la ingeniería de tejido óseo, sino que también funcionaría como biosensor y dispositivo de almacenamiento de energía [62, 63], debido a la propiedad de autoalimentación del hidrogel piezoeléctrico.

La reparación después de una lesión ósea implica múltiples etapas de reacción biológica: 1) En la etapa inicial de la respuesta inflamatoria, las señales relacionadas con el trauma pueden activar las células inmunitarias, lo que provoca cambios en los gradientes químicos de los factores inflamatorios y el reclutamiento de más células inmunitarias en el sitio. de lesión ósea, desencadenando así la respuesta inmune; 2) Inflamación crónica: 3 a 5 días después de la lesión, los tejidos necróticos y las bacterias pueden eliminarse mediante inflamación aguda, y el sitio del defecto óseo entra en una etapa de inflamación crónica. En esta etapa, los macrófagos en el sitio del defecto se polarizan gradualmente hacia el fenotipo M2 (tipo antiinflamatorio) y el cuerpo induce a las células madre a diferenciarse en varias células funcionales a través de la regulación y el reclutamiento inmunológico, promoviendo la producción de nuevos tejidos óseos [64 , sesenta y cinco]. El microambiente inflamatorio puede transformarse en un microambiente de reparación mediante la secreción de citoquinas regenerativas como Runx2 y TGF-β [66]. Por tanto, cómo promover la polarización de los macrófagos al tipo M2 en la reparación ósea es un problema urgente a abordar en la regeneración ósea. Muchos informes han demostrado que el microambiente eléctrico endógeno del tejido óseo primario puede reproducirse mediante la preparación de materiales piezoeléctricos compuestos [9, 15, 67]. Cuando se aplicó el hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/PBT a los macrófagos, los macrófagos se transformaron al fenotipo M2.

Además, analizamos las vías de señalización clave mediante las cuales el hidrogel piezoeléctrico regula la polarización de los macrófagos mediante pruebas transcripcionales. Las pruebas de inhibición podrían verificar que los hidrogeles CG/PHA/PBT regulan positivamente la fosforilación de PI3K/Akt para regular la polarización de los macrófagos M2. En el diagrama esquemático de la Fig. 7, resumimos el mecanismo del hidrogel piezoeléctrico a través de experimentos in vitro e in vivo. El microambiente piezoeléctrico y la estimulación causada por el hidrogel piezoeléctrico actúan sobre los receptores de la superficie de los macrófagos y luego conducen a la activación de la vía de señalización descendente para regular el microambiente de regeneración positiva. Liu y cols. [68] afirmaron que la integrina β1 es una molécula de señalización aguas arriba de PI3K/Akt, y sus materiales de soporte biológico desarrollados pueden regular la polarización de los macrófagos mediante la activación de los receptores de superficie de los macrófagos de la integrina β1 para activar la vía de señalización de PI3K/Akt. Duan et al. [41] encontraron que CD44 y la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) son moléculas aguas arriba de PI3K/Akt, mientras que el objetivo de la rapamicina en los mamíferos (mTOR) es la proteína aguas abajo de PI3K/Akt que regula la polarización de los macrófagos. Combinados con nuestros resultados, estos hallazgos demuestran la importancia de la vía de señalización PI3K/Akt en la polarización de los macrófagos. Además de esto, Ma et al. [69] afirmaron que la vía de señalización del receptor tipo Toll (TLR) está implicada en la regulación de la polarización de los macrófagos mediante el análisis modular y el análisis de enriquecimiento funcional. Además, la activación de la señalización de Notch puede regular la diferenciación de macrófagos en M1 y desempeñar un papel en la promoción de la inflamación y la actividad antitumoral [70]. Estos resultados y algunos otros informes nos proporcionan objetivos proteicos clave para que podamos desarrollar estructuras y fármacos que promuevan la regeneración del tejido óseo. Además, en esta investigación solo aplicamos este hidrogel piezoeléctrico a la reparación ósea, y ampliaríamos la aplicación de este tipo de hidrogel piezoeléctrico a la investigación de ingeniería de nervios, ligamentos, músculos y tejidos de la piel en estudios futuros.

En este estudio, diseñamos y sintetizamos un hidrogel piezoeléctrico poroso versátil que tiene buenas funciones inmunorreguladoras, angiogénicas y osteogénicas y puede lograr rápidamente la formación de hueso nuevo. Introdujimos nanopartículas de PHA y PBT en el hidrogel, que no solo pueden mejorar las propiedades físicas y químicas y la biocompatibilidad del hidrogel, sino que también promueven la actividad osteogénica. Este andamio de hidrogel puede promover significativamente la adhesión, proliferación y osteogénesis de los osteoblastos (MC3T3-E1). Dado que el hidrogel piezoeléctrico puede generar continuamente estimulación eléctrica endógena, tiene los correspondientes efectos inmunomoduladores, que pueden promover sinérgicamente la regeneración ósea y la reconstrucción de la red vascular. Varios experimentos verificaron que el versátil hidrogel piezoeléctrico creaba un nicho inmunológico favorable a la curación. Se observaron muchos macrófagos antiinflamatorios (fenotipo M2) y pocos macrófagos proinflamatorios (fenotipo M1) en el sitio del defecto óseo tratado con hidrogel piezoeléctrico. El hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/PBT activa el eje de señalización PI3K/Akt para regular la polarización de los macrófagos M2. Por lo tanto, investigamos en detalle la capacidad del hidrogel para promover la polarización del fenotipo de macrófagos M2, mejorar la diferenciación osteogénica y la angiogénesis y acelerar la regeneración y remodelación ósea en este estudio. El implante de hidrogel piezoeléctrico preparado es un tipo de biomaterial de andamio bioactivo potencial con una capacidad especial para generar un microambiente piezoeléctrico. Según estas observaciones, el andamio de tejido óseo de hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/PBT muestra potencial como esquema de injerto óseo para aplicación clínica en la reparación de grandes defectos óseos.

Los datos que sustentan este artículo se pueden encontrar dentro del texto y en el archivo de información complementaria. Cualquier dato adicional y los datos que respaldan los argumentos de este artículo están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Corriente alterna

Fosfatasa alcalina

rojo alizarina

titanato de bario

Proteína morfogenética ósea 2

quitosano

ADN complementario

colágeno tipo I

Ácido etilendiaminotetraacético

Gelatina

Células endoteliales de la vena umbilical humana

hidroxiapatita

Hematoxilina y eosina

Óxido nítrico sintasa inducible

Enciclopedia de genes y genomas de Kioto

Células madre mesenquimales

osteopontina

osteocalcina

polidopamina

Hidroxiapatita cerámica modificada con polidopamina

Especies de oxígeno reactivas

Factor de transcripción 2 relacionado con Runt

Receptor tipo peaje

Microscopio de transmisión por electrones

Factor de crecimiento vascular endotelial

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No aplica.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82202352, 82271629), el Fondo Conjunto de Investigación Interdisciplinaria y Medicina Traslacional del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (ZNLH202202), el Proyecto financiado por la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2023M732711) y la Universidad de Wenzhou. Beca Universitaria de Medicina (QTJ23004).

Ping Wu, Lin Shen, Hui-Fan Liu y Xiang-Hui Zou contribuyeron igualmente a este trabajo.

Laboratorio clave de diagnóstico por imágenes e investigación de intervenciones mínimamente invasivas, Quinto Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Wenzhou, Lishui, 323000, Zhejiang, China

Ping Wu, Lin Shen, Juan Zhao, Yu Huang y Zhou-Guang Wang

Laboratorio Oujiang (Laboratorio de Zhejiang para Medicina Regenerativa, Visión y Salud Cerebral), Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Médica de Wenzhou, Wenzhou, 325000, Zhejiang, China

Ping Wu, Xiao-Kun Li y Zhou-Guang Wang

Departamento de Cirugía de la Columna Vertebral y Tumores Musculoesqueléticos, Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan, Wuhan, 430071, China

Hui-Fan Liu, Yu-Fan Zhu, Min-Hao Wu y Lin Cai

Centro Nacional de Investigación en Ingeniería para Nanomedicina, Facultad de Ciencias y Tecnología de la Vida, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, 430074, China

Xiang-Hui Zou, Chao Xu y Zhi-Qiang Luo

Departamento de Educación en el Extranjero, Universidad de Jimei, Xiamen, 361021, Fujian, China

Zhao Yu Li

Escuela y Hospital de Estomatología, Universidad Médica de Wenzhou, Wenzhou, 325035, Zhejiang, China

Li Hua Luo

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PW, MHW y ZGW diseñaron todo el proyecto y escribieron el manuscrito. PW, HFL y MHW realizaron la mayoría de los experimentos. XHZ realizó la prueba piezoeléctrica. JZ, YH, CX y LHL realizaron los experimentos con animales. YFZ dibujó los esquemas. LS, ZYL, ZQL, LC y XKL fueron responsables de la edición y revisión del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Min-Hao Wu, Lin Cai, Xiao-Kun Li o Zhou-Guang Wang.

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (No. ZN2022282).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que puedan influir en el trabajo presentado en este artículo.

Las secuencias de cebadores de cada gen.

Diagrama de flujo de experimentos con animales y pruebas correspondientes. Fig. S2 Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanopartículas de titanato de bario. Fig. S3 Análisis de hidrogel piezoeléctrico que promueve la polarización de macrófagos. Fig. S4 Secreción de citocinas pro-curativas en macrófagos estimuladas por hidrogeles piezoeléctricos. Fig. S5 Análisis cuantitativo representativo de la capacidad migratoria de las células HUVEC en el ensayo Transwell (a) y de migración de curación de heridas (b) para las Fig. 4b-c. Fig. S6 Evaluación in vitro de la actividad osteogénica. Fig. S7 Evaluación in vivo de la regulación inmune; angiogénesis y osteogénesis después de la implantación de hidrogel piezoeléctrico. Fig. S8 Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica de Col-1, Runx2, OPN, CD31 y CD34 dentro del área del defecto 8 semanas después de la implantación. Fig. S9 Resultados de la secuenciación del transcriptoma de macrófagos bajo estimulación piezoeléctrica de hidrogel. Fig. S10 El hidrogel piezoeléctrico CG/PHA/5%PBT regula la reparación ósea a través del eje PI3K/Akt.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La exención de dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.

Reimpresiones y permisos

Wu, P., Shen, L., Liu, HF. et al. La combinación de capacidades inmunomoduladoras, angiogénicas y osteogénicas en un andamio de ingeniería de tejidos de hidrogel piezoeléctrico para la medicina militar. Military Med Res 10, 35 (2023). https://doi.org/10.1186/s40779-023-00469-5

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Recibido: 04 de abril de 2023

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s40779-023-00469-5

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